中国生物制品规程!药典的中国药典(Ch.P)

1 、药典的中国药典(Ch.P)

始自1930年出版的《中华药典》 。1949年中华人民共和国成立后 ，已编订了《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）1953 、1963 、1977 、1985 、1990 、1995 、2000 、2005 、2010年版共九个版次 。

1949 年10 月1 日中华人民共和国成立后 ，党和政府十分关怀人民的医药卫生保健工作 ，当年11 月卫生部召集在京有关医药专家研讨编纂药典问题 。1950 年1 月卫生部从上海调药学专家孟目的教授负责组建中国药典编纂委员会和处理日常工作的干事会 ，筹划编制新中国药典 。

1950 年4 月在上海召开药典工作座谈会 ，讨论药典的收载品种原则和建议收载的品种 ，并根据卫生部指示 ，提出新中国药典要结合国情 ，编出一部具有民族化 、科学化 、大众化的药典 。随后 ，卫生部聘请药典委员49 人 ，分设名词 、化学药 、制剂 、植物药 、生物制品 、动物药 、药理 、剂量8 个小组 ，另聘请通讯委员35 人 ，成立了第一届中国药典编纂委员会 。卫生部部长李德全任主任委员 。

1951 年4 月24 日至28 日在北京召开第一届中国药典编纂委员会第一次全体会议 ，会议对药典的名称 、收载品种 、专用名词 、度量衡问题以及格式排列等作出决定 。干事会根据全会讨论的意见 ，对药典草案进行修订 ，草案于1952 年底报卫生部核转政务院文教委员会批准后 ，第一部《中国药典》 1953 年版由卫生部编印发行 。

1953 年版药典共收载药品531 种 ，其中化学药215 种 ，植物药与油脂类65 种 ，动物药13 种 ，抗生素2 种 ，生物制品25 种 ，各类制剂211 种 。药典出版后 ，于1957 年出版《中国药典》 1953 年版第一增补本 。1955 年卫生部成立第二届药典委员会 ，聘请委员49 人 ，通讯委员68 人 ，但这届委员会因故未能进行工作 。1957 年成立第三届药典委员会 ，聘请委员80 人 ，药学专家汤腾汉教授为这届委员会主任委员（不设通讯委员） ，同年7 月28 日至8 月5日在北京召开第一次全体委员会议 ，卫生部李德全部长作了药典工作报告 ，特别指出第一版中国药典没有收载广大人民习用的中药 ，是个很大的缺陷 。会议在总结工作的基础上 ，通过了制订药典的原则 ，讨论了药典的性质和作用 ，并修改了委员会章程 ，会议一致认为应把合乎条件的中药收载到药典中 。8 月27日卫生部批准委员会分设药理与医学 、化学药品 、药剂 、生化药品 、生药 、生物制品六个专门委员会及名词小组 ，药典委员会设常务委员会 ，日常工作机构改称秘书室 。1958 年经常务委员会研究并经卫生部批准 ，增聘中医专家8 人 、中药专家3 人组成中医药专门委员会 ，组织有关省市的中医药专家 ，根据传统中医药的理论和经验 ，起草中药材和中药成方（即中成药）的标准 。

1959 年6 月25 日至7 月5日在北京召开这届委员会第二次全体会议 ，会议主要审议新版药典草稿 ，并确定收载品种 。草稿经修订补充后 ，分别由各专门委员会审定 ，于1962 年完成送审稿 ，报请国务院批准后付印 ，1965 年1 月26 日卫生部公布《中国药典》 1963 年版 ，并发出通知和施行办法 。

1963 年版药典共收载药品1310种 ，分一 、二两部 ，各有凡例和有关的附录 。一部收载中医常用的中药材446 种和中药成方制剂197 种；二部收载化学药品667 种 。此外 ，一部记载药品的“功能与主治” ，二部增加了药品的“作用与用途” 。

1966 年由于“文革”动乱影响 ，药典委员会工作陷于停顿 。1972 年4 月28 日国务院批复卫生部“同意恢复药典委员会 ，四部（卫生部 、燃料化学工业部 、商业部 、解放军总后卫生部）参加 ，卫生部牵头” 。据此 ，同年5 月31 日至6 月10日在北京召开了编制国家新药典工作会议 ，出席会议的有全国各省（自治区 、直辖市）的药品检验 、药政管理以及有关．单位代表共88 人 。这次会议着重讨论了编制药典的指导思想 、方法 、任务和要求 ，交流了工作经验 ，确定了编制新药典的方案 ，并分工落实起草任务 。1973 年4 月 ，在北京召开第二次全国药典工作会议 ，讨论制订药典的一些原则要求 ，以及中西药品的标准样稿和起草说明书 ，并根据药材主产地和药品生产情况 ，调整了起草任务 。1979 年10 月4 日卫生部颁布《中国药典》 1977 年版自1980 年1 月1 日起执行 。1977 年版药典共收载药品1925 种 。一部收载中草药材（包括少数民族药材） 、中草药提取物 、植物油脂以及一些单味药材制剂等882 种 ，成方制剂（包括少数民族药成方）270 种 ，共1 152 种；二部收载化学药品 、生物制品等773 种 。

1979 年 ，由卫生部聘请委员112 人组建第四届药典委员会 ，卫生部部长钱信忠兼任主任委员 。同年11月22 日至28 日在北京召开这届第一次全体委员会议 ，会议讨论修改了委员会章程 、药品标准工作管理办法及工作计划 。委员会分设：中医 、中药 、医学与药理 、化学药 、生化药 、药剂 、抗生素 、生物制品 、放射性药品及名词10 个专业组 。由有关专业组分别推荐新药典收载的品种 ，中医专业组负责审查拟定一部收载的品种范围；医学与药理专业组负责审查拟定二部收载的品种范围；由主产地所在的省（自治区 、直辖市）药品检验所和有关单位负责起草标准 ，药典委员会办公室组织交叉复核 ，有些项目组成专题协作组通过实验研究后起草 ，标准草案经有关专业组委员并邀请有关药品检验所和药厂的代表讨论审议后报卫生部审批 。《中国药典》 1985 年版于1985 年9 月出版 。1986 年4 月1 日起执行 。该版药典共收载药品1489 种 。一部收载中药材 、植物油脂及单味制剂506 种 ，中药成方207 种 ，共713 种；二部收载化学药品 、生物制品等776 种 。

1985 年7 月1 日《中华人民共和国药品管理法》正式执行 ，该法规定“药品必须符合国家药品标准或者省 、自治区 、直辖市药品标准” 。明确“国务院卫生行政部门颁布的《中华人民共和国药典》和药品标准为国家药品标准” 。“国务院卫生行政部门的药典委员会 ，负责组织国家药品标准的制定和修订” 。进一步确定了药品标准的法定性质和药典委员会的任务 。

1986 年卫生部根据药典委员会章程聘请委员150 人组建第五届药典委员会 ，由卫生部崔月犁部长兼任主任委员 ，常设办事机构改为秘书长制 。同年5 月5 日至8 日召开第五届第一次全体委员会议 ，讨论修订了委员会章程 ，通过了“七五”期间标准工作设想 ，确定编制《中国药典》 1990 年版的指导思想和原则要求 。分别举行中药材 、中药成方制剂 、化学药 、抗生素 、生化药及药理等专业会议 ，安排起草和科研任务 。1987 年11 月出版《中国药典》 1985 年版增补本 ，新增品种23 种 ，修订品种172 种 ，附录21 项 。1988 年10 月 ，第一部英文版《中国药典》 1985 年版正式出版 。同年还出版了药典二部注释选编 。1989 年3 月 ，各地起草的1990 年版药典标准初稿基本完成 ，药典委员会常设机构开始组织审稿和编辑加工 。同年12 月在北京举行药典委员会主任委员 、副主任委员和各专业组长扩大会议进行审议 ，报卫生部批准后付印 。1990 年12 月3 日卫生部颁布《中国药典》 1990 年版自1991 年7 月1日起执行 。

这版药典分一 、二两部 ，共收载品种1751 种 。一部收载784 种 ，其中中药材 、植物油脂等509 种 ，中药成方及单味制剂275 种；二部收载化学药品 、生物制品等967 种 。与1985 年版药典收载品种相比 ，一部新增80 种 ，二部新增213 种（含1985 年版药典一部移人5 种）；删去25 种（一部3 种 ，二部22 种）；对药品名称 ，根据实际情况作了适当修订 。药典二部品种项下规定的“作用与用途”和“用法与用量” ，分别改为“类别”和“剂量” ，另组织编著《临床用药须知》一书 ，以指导临床用药 。有关品种的红外光吸收图谱 ，收入《药品红外光谱集》另行出版 ，该版药典附录内不再刊印 。

1991 年组建第六届药典委员会 ，由卫生部聘请委员共168 人 ，卫生部陈敏章部长兼任主任委员 。同年5 月16 日至18 日召开第一次全体委员会议 ，讨论通过了委员会的章程和编制《中国药典》 1995 年版设计方案 ，并成立由主任委员 、副主任委员和专家共11 人组成的常务委员会 。分设13 个专业组 ，即：中医专业组 、中药材专业组 、中成药专业组 、西医专业组 、药理专业组 、化学药专业一组 、化学药专业二组 、化学药专业三组 、抗生素专业组 、生化药品专业组 、生物制品专业组 、放射性药品专业组 、药品名词专业组 。会后 ，各专业组分别召开专业组委员扩大会议 ，安排落实全会提出的任务 。

1993 年《中国药典》 1995 年版 、附录初稿发往各地作为起草 、修订正文标准的依据 。1994 年7 月各地基本完成了标准的起草任务 ，由药典委员会各专业委员会分别组织审稿工作 。1994 年11 月29 日提交常务委员会扩大会议讨论审议 ，获得原则通过 ，报请卫生部审批付印 。卫生部批准颁布《中国药典》 1995 年版自1996 年4 月l 日起执行 。

这版药典收载品种共计2375 种 。一部收载920 种 ，其中中药材 、植物油脂等522 种 ，中药成方及单味制剂398 种；二部收载1 455 种 ，包括化学药 、抗生素 、生化药 、放射性药品 、生物制品及辅料等 。一部新增品种142 种 ，二部新增品种4 ”种 。二部药品外文名称改用英文名 ，取消拉丁名；中文名称只收载药品法定通用名称 ，不再列副名 。编制出版《药品红外光谱集》第一卷（1995 年版） 。《临床用药须知》一书经修订 ，随《中国药典》 1995 年版同时出版 ，经卫生部批准 ，其中的“适应证”和“剂量”部分作为药政和生产部门宣传使用和管理药品的依据 。

这届药典委员会除完成1995 年版药典的编制外 ，还于1992 年 、1993 年先后编制出版《中国药典》1990 年版第一 、第二增补本 ，二部注释和一部注释选编 ，《中药彩色图集》和《中药薄层色谱彩色图集》以及《中国药品通用名称》等标准方面的配套丛书 。《中国药典》 1990 年版英文版亦于1993 年7 月出版发行 。

为加强国家药品标准工作 ，1993 年5 月21 日卫生部决定将药典委员会常设机构从中国药品生物制品检定所分离出来 ，作为卫生部的直属单位 ，这是药典委员会机构史上一次重大的改革 。

1996 年5 月经卫生部批准 ，第七届药典委员会成立 ，由卫生部聘请204 位委员组成 ，其中名誉委员18 人 ，卫生部陈敏章部长兼任主任委员．1998 年9 月 ，根据中编办（1998 ) 32 号文：卫生部药典委员会更名为国家药典委员会 ，并成建制划转国家药品监督管理局管理 。因管理体制的变化及1999 年3 月陈敏章部长逝世 ，在征得有关领导部门同意后 ，按照第七届药典委员会章程精神 ，经1999 年12 月第七届药典委员会常务委员会议一致同意调整主任委员 、副主任委员 。这届委员会设专业委员会共16 个 ，分别为：中医专业委员会 、中药第一专业委员会 、中药第二专业委员会 、中药第三专业委员会 、中药第四专业委员会 、医学专业委员会 、药品名词专业委员会 、附录专业委员会 、制剂专业委员会 、药理专业委员会 、化学药品第一专业委员会 、化学药品第二专业委员会 、抗生素专业委员会 、生化药品专业委员会 、放射性药品专业委员会 、生物制品专业委员会 。

1996 年召开第七届药典委员会常务委员会第一次会议 ，通过了这届药典委员会提出的“《中国药典》 2000年版设计方案” ，一部确立了“突出特色 ，立足提高” ，二部确立了“赶超与国情相结合 ，先进与特色相结合”的指导思想 。根据这届委员会提出的设计方案 ，1996 年10 月起 ，各专业委员会先后召开会议 ，落实设计方案提出的任务并分工进行工作 。1997 年底 ，首先完成了附录与制剂通则的修改 ，并下发各起草单位征求意见 。1998 年底药典初稿完成 ，经进一步征求全国各有关方面的意见 ，至1999 年10 月底 ，先后召开了16 个专业委员会审定稿会议 。《中国药典》 2000 年版于1 999 年12 月经第七届药典委员会常务委员会议审议通过 ，报请国家药品监督管理局批准颁布 ，于2000 年1月出版发行 ，2000 年7 月1 日起正式执行 。

2000 年版药典共收载药品2691 种 ，其中一部收载992 种 ，二部收载1699 种 。一 、二两部共新增品种399 种 ，修订品种562 种 。这版药典的附录作了较大幅度的改进和提高 ，一部新增附录10 个 ，修订附录31 个；二部新增附录27 个 ，修订附录32 个 。二部附录中首次收载了药品标准分析方法验证要求等六项指导原则 ，对统一 、规范药品标准试验方法起指导作用 。现代分析技术在这版药典中得到进一步扩大应用 。第七届药典委员会还完成了《中国药典》 1995 年版一九九七年增补本 、一九九八年增补本 、《中国药品通用名称》（一九九八年增补本）及《药品红外光谱集》（第二卷） 、《临床用药须知》（第三版） 。1997 年完成了《中国药典》 1995 年版英文版 。为加强国际合作与交流 ，第七届药典委员会还决定《中国药典》 2000 年版英文版与中文版同步出版 。

以往几版药典中的“剂量” 、“注意”项内容 ，由于过于简单不能准确反映临床用药的实际情况 ，根据“《中国药典》 2000 年版设计方案”的提议 ，这版药典二部取消了这两项 ，其有关内容移至《中国药典》 2000 年版《临床用药须知》一书中 。

2002 年10 月经国家药品监督管理局（2003 年9 月更名为国家食品药品监督管理局）批准 ，第八届药典委员会成立 。由国家药品监督管理局聘请312 位委员组成 ，不再设立名誉委员 。国家药品监督管理局局长郑筱英兼任主任委员 。原常务委员会更名为执行委员会 ，由全体委员大会授权审定《中国药典》及国家药品标准的重大事项 。本届委员会设专业委员会共24 个 。在上一届委员会的基础上 ，增设了民族药专业委员会（筹） 、微生物专业委员会 、药品包装材料与辅料专业委员会；原生物制品专业委员会扩增为血液制品专业委员会 、病毒制品专业委员会 、细菌制品专业委员会 、体细胞治疗与基因治疗专业委员会 、重组制品专业委员会和体外诊断用生物试剂专业委员会 。

2002 年10 月召开第八届药典委员会全体大会及执行委员会第一次会议 ，通过了本届药典委员会提出的“《中国药典》 2005 年版设计方案” 。设计方案明确了坚持继承与发展 、理论与实际相结合的方针；确定了“科学 、实用 、规范”等药典编纂原则；决定将《中国生物制品规程》并人药典 ，设为药典三部；并编制首部中成药《临床用药须知》 。

2002 年11 月起 ，各专业委员会先后召开会议 ，安排设计方案提出的任务并分别进行工作 。2003 年7月 ，首先完成了附录草案 ，并发有关单位征求意见 。2004 年初药典附录与品种初稿基本完成 ，增修订内容陆续在国家药典委员会网站上公示3 个月 ，征求全国各有关方面的意见 。6 月至8 月 ，各专业委员会相继召开了审定稿会议 。9 月 ，《中国药典》 2005 年版经过第八届药典委员会执行委员会议审议通过 ，12 月报请国家食品药品监督管理局批准颁布 ，于2005 年1 月出版发行 ，2005 年7 月1 日起正式执行 。本版药典收载的品种有较大幅度的增加 。共收载3214 种 ，其中新增525 种 。药典一部收载品种1146 种 ，其中新增154 种 、修订453 种；药典二部收载1967 种 ，其中新增327 种 、修订522 种；药典三部收载101 种 ，其中新增44 种 、修订57 种 。《中国药典》 2000 年版收载而本版药典未收载的品种共有9 种 。2000 年版《中国生物制品规程》及2002 年增补本收载而未收载人药典的品种共有123 种 。

本版药典收载的附录 ，药典一部为98 个 ，其中新增12 个 、修订48 个 ，删除1 个；药典二部为137 个 ，其中新增13 个 、修订65个 、删除1 个；药典三部为140 个 ，其中新增62 个 、修订78 个 ，删除1 个 。一 、二 、三部共同采用的附录分别在各部中予以收载 ，并进行了协调统一 。

本版药典在主任委员的积极倡导下 ，对药品的安全性问题更加重视 。药典一部采用原子吸收和电感耦合等离子体质谱法增加了有害元素（铅 、镉 、砷 、汞 、铜）测定法 ，并规定了有害元素的限度；药典一部还增加了中药注射剂安全性检查法应用指导原则 。药典二部有126 个静脉注射剂增订了不溶性微粒检查 ，增修订细菌内毒素检查的品种达112 种；残留溶剂测定法中引入国际间已协调统一的有关残留溶剂的限度要求 ，并有24 种原料药增订了残留溶剂检查；药典二部还增加了药品杂质分析指导原则 、正电子类和锝[ 99mm Tc ]放射性药品质量控制指导原则 。药典三部增订了逆转录酶活性检查法 、人血白蛋白铝残留量测定法等 ，牛血清白蛋白残留量及CHO 细胞蛋白残留量等检测方法也得到改进 。本版药典结合我国医药工业的现状和临床用药的实际情况 ，将由卫生部颁布的原《澄明度检查细则和判断标准》修订为“可见异物检查法” ，以加强注射剂等药品的用药安全 。

本版药典坚持注重环保的一贯性原则 ，在品种中对苯等有害溶剂 ，尽可能采用其他溶剂替代 。本版药典根据中医辨证施治的理论 ，对收载的中成药标准项下的【功能与主治】进行了科学规范 ，为准确理解中成药的功能主治及合理用药提供了保证 ，促进中医药在新时期的健康发展 。

本版药典三部源于《中国生物制品规程》 。自1951 年以来 ，该规程已有六版颁布执行 ，分别为1951 年及1952 年修订版 、1959 年版 、1979 年版 、1990 年版及1993 年版（诊断制品类） 、1995 年版 、2000 年版及2002 年增补本 。2002 年翻译出版了第一部英文版《中国生物制品规程》（2000 年版） 。

第八届药典委员会还完成了《中国药典》 2000 年版2002 年增补本 、2004 年增补本 、《中国药品通用名称》（2005 年版）及《药品红外光谱集》（第三卷） 、《临床用药须知》（中成药第一版 、化学药第四版） 。2005 年 ，完成了《中国药典》 2005 年版英文版．为加强国际合作与交流 ，本届委员会期间 ，与美国药典委员会联合举办了首届中美药典论坛 。

为加强和提高国家标准工作效率与水平 ，常设机构完成了办公自动化及标准数据库的建设 ，实现了已颁布标准的计算机网络检索查询与统计分析 。

《中国药典》的特色之一即在于它继承发扬了传统医药学的成果 ，并实现了中西医药学的结合 。

2010版《中国药典》将于2010年10月1日正式实施 。

台湾于1949年和1980年也先后出版了《中华药典》第二版和第三版 。《中华药典》第三版收载各类药品746种 。 （一）.凡例

1.名称与编排

2.检验方法与限度

3.标准品 、对照品

4.精确度

（二）正文

名称（英文和汉语拼音） ,结构式 ,性状鉴别 、检查 、含量测定 ,类别 ,贮藏 ,制剂

（三）附录

组成：制剂通则 、检测方法和指导原则 、滴定液的配制与标定等

（四）索引

一部：中文 、汉语拼音 、拉丁名 、拉丁学名

二部：中文索引： 英文索引：

三部：中文索引： 英文索引：

2 、进口药品批件如何办理

现要注册申报一批“肿瘤标志物类”和“乙肝五项”的体外诊断试剂 ，按照目前国家的分类标准 ，我们这些试剂属于按药品来管理的体外诊断试剂 ，需按药品来注册 ，但与药品不同的是在注册过程中SFDA不发《进口药品临床研究批件》 ，而我们这些试剂在海关进关时 ，海关要求我们提供《进口药品临床研究批件》或者《进口药品质量标准复核通知单》才能进关 ，问题是我们在注册受理前就要拿这些试剂到国内医院做临床试验 ，这种情况如何处理？

3 、无菌检查和微生物限度检查的区别

1 、检验方法不同

（1）无菌检查是指对药典规定的药品 、敷料 、缝线 、无菌器具等品种进行无菌检查的方法 。

（2）微生物限度检查是检查非处方杀菌剂及其原料 、辅料的微生物污染程度的一种方法 。

2 、检验要求环境不同

（1）无菌检查是在洁净的A级单向流通空气区或隔离系统中进行的 。整个过程应严格遵守无菌操作 ，防止微生物污染 。必须验证单向气流区域和工作台的清洁度 。生物制品的无菌检验按照《中国生物制品规程》中有关无菌检验的规定执行 。

（2）微生物限度检查：微生物限度检查应在环境洁净度10000级以下的局部洁净度100级的单向气流区进行 。整个检验过程必须严格遵守无菌操作 ，防止再污染 。

3 、判断结果方法不同

（1）用需气菌 、厌气菌培养基4管及真菌培养基2管 ，分别接种金黄色葡萄球菌 、产孢梭菌和白色念珠菌 。将一管添加到规定数量的试验产品中 ，并将所有培养基管放置在规定温度下3-5天 。如果微生物在每种培养基24小时内生长良好 ，则试样没有抑菌作用 。

（2）微生物限度检查：被检培养基平均菌落数与对照培养基平均菌落数之比大于70% ，菌落大小应与对照培养基相同 。确定该介质的适用性符合规定 。

来源：百度百科-微生物限度检查法

来源：百度百科-无菌检查法

4 、做蛋白纯化的人主要去哪工作？

蛋白质的分离纯化方法

2.1根据分子大小不同进行分离纯化

蛋白质是一种大分子物质 ,并且不同蛋白质的分子大小不同 ,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白

质和小分子物质分开 ,并使蛋白质混合物也得到分离 。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析 、超滤 、离心和凝胶过滤等 。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法 。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中 ,再浸入透析液进行分离 。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜 ,而蛋白质被截留在半透膜上的过程 。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开 。它们经常和盐析 、盐溶方法联合使用 ,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐 。由于超滤过程中 ,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞 ,以致超滤速度减慢 ,截流物质的分子量也越来越小 。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜 ,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果

离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法 。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开 。例如 ,在从大米渣中提取蛋白质的实验中 ,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后 ,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3] 。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心 。常用的密度梯度有蔗糖梯度 、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度 。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度 。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白 ,得到的产品纯度高但产量偏低 。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果 ,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白 。凝胶过滤也称凝胶渗透层析 ,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一 。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时 ,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构 ,而被排阻在凝胶珠之外 ,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之 ,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外 。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶 、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等 。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果 ,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa 、成分是多糖∶蛋白质(88∶12) 、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1] 。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7] 。

2.2 根据溶解度不同进行分离纯化

影响蛋白质溶解度的外部条件有很多 ,比如溶液的pH值 、离子强度 、介电常数和温度等 。但在同一条件下 ,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度 ,根据蛋白质分子结构的特点 ,适当地改变外部条件 ,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度 ,达到分离纯化蛋白质的目的 。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节 、蛋白质的盐溶和盐析 、有机溶剂法 、双水相萃取法 、反胶团萃取法等 。

等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法 。每种蛋白质都有自己的等电点 ,而且在等电点时溶解度最

低;相反 ,有些蛋白质在一定pH值时很容易溶解 。因而可以通过调节溶液的pH值来分离纯化蛋白质 。王洪新等[8]研究茶叶蛋白质提取过程发现 ,pH值为时茶叶蛋白提取效果最好 ,提取率达到36·8% ,初步纯化得率为91·0% 。李殿宝[9]在从葵花脱脂粕中提取蛋白质时将蛋白溶液的pH值调到3~4 ,使目标蛋白于等电点沉淀出来 。等电点沉淀法还应用于葡萄籽中蛋白质的提取 。李凤英等[10]测得葡萄籽蛋白质的等电点为3·8 。他们利用碱溶法提取葡萄籽蛋白质 ,得到了最佳的提取工艺为:以1×10-5mol·L-1的NaOH溶液 ,按1∶5的料液比 ,在40℃搅拌40 min ,葡萄籽蛋白质提取率达73·78% 。另外还可以利用碱法提取大米蛋白 ,其持水性 、吸油性和起泡性等均优于酶法提取[11] 。利用酸法提取得到的鲢鱼鱼肉蛋白质无腥味 、色泽洁白 ,蛋白质产率高达90%[12] 。

蛋白质的盐溶和盐析是中性盐显著影响球状蛋白质溶解度的现象 ,其中 ,增加蛋白质溶解度的现象称盐溶 ,反之为盐析 。应当指出 ,同样浓度的二价离子中性盐 ,如MgCl2 、(NH4)2SO4对蛋白质溶解度影响的效果 ,要比一价离子中性盐如NaCl 、NH4Cl大得多 。在葡萄籽蛋白提取工艺中除了可以利用碱溶法还可以利用盐溶法来提取蛋白质 ,其最佳提取工艺是:以10%NaCl溶液 ,按1∶25的料液比 ,在30℃搅拌提取30min ,蛋白质提取率为57·25%[10] 。盐析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法 ,如多聚磷酸钠絮凝法 、硫酸铵盐析法 ,其中硫酸铵盐析法广泛应用于生产 。由于硫酸铵在水中呈酸性 ,为防止其对蛋白质的破坏 ,应用氨水调pH值至中性 。为防止不同分子之间产生共沉淀现象 ,蛋白质样品的含量一般控制在0·2% ~2·0% 。利用盐溶和盐析对蛋白质进行提纯后 ,通常要使用透析或者凝胶过滤的方法除去中性盐[13] 。

有机溶剂提取法的原理是:与水互溶的有机溶剂(如甲醇 、乙醇)能使一些蛋白质在水中的溶解度显著降低;而且在一定温度 、pH值和离子强度下 ,引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同 ,因此 ,控制有机溶剂的浓度可以分离纯化蛋白质 。例如 ,在冰浴中磁力搅拌下 ,在4℃预冷的培养液中缓慢加入乙醇(-25℃) ,可以使冰核蛋白析出 ,从而纯化冰核蛋白[14] 。由于在室温下 ,有机溶剂不仅能引起蛋白质的沉淀 ,而且伴随着变性 。因此 ,通常要将有机溶剂冷却 ,然后在不断搅拌下加入有机溶剂防止局部浓度过高 ,蛋白质变性问题就可以很大程度上得到解决 。对于一些和脂质结合比较牢固或分子中极性侧链较多 、不溶于水的蛋白质 ,可以用乙醇 、丙酮和丁醇等有机溶剂提取 ,它们有一定的亲水性和较强的亲脂性 ,是理想的提取液 。冷乙醇分离法提取免疫球蛋白最早由Cohn于1949年提出 ,用于制备丙种球蛋白 。冷乙醇法也是目前WHO规程和中国生物制品规程推荐的方法 ,不仅分辨率高 、提纯效果好 、可同时分离多种血浆成分 ,而且有抑菌 、清除和灭病毒的作用[15] 。

萃取是分离和提纯有机化合物常用的一种方法 ,而双水相萃取和反胶团萃取可以用来分离蛋白质 。双水相萃取技术(Aqueous two phase extraction ,ATPE)是指亲水性聚合物水溶液在一定条件下形成双水相 ,由于被分离物在两相中分配的不同 ,便可实现分离 ,被广泛用于生物化学 、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取 。此方法可以在室温环境下进行 ,双水相中的聚合物还可以提高蛋白质的稳定性 ,收率较高 。对于细胞内的蛋白质 ,需要先对细胞进行有效破碎 。目的蛋白常分布在上相并得到浓缩 ,细胞碎片等固体物分布在下相中 。采用双水相系统浓缩目的蛋白 ,受聚合物分子量及浓度 、溶液pH值 、离子强度 、盐类型及浓度的影响[16] 。

反胶团萃取法是利用反胶团将蛋白质包裹其中而达到提取蛋白质的目的 。反胶团是当表面活性剂

在非极性有机溶剂溶解时自发聚集而形成的一种纳米尺寸的聚集体 。这种方法的优点是萃取过程中蛋

白质因位于反胶团的内部而受到反胶团的保护 。程世贤等[17]就利用反胶团萃取法提取了大豆中的蛋白质 。

2.3 根据电荷不同进行分离纯化

根据蛋白质的电荷即酸碱性质不同分离蛋白质的方法有电泳和离子交换层析两类 。

在外电场的作用下 ,带电颗粒(如不处于等电点状态的蛋白质分子)将向着与其电性相反的电极移动 ,这

种现象称为电泳 。聚丙烯酰胺电泳是一种以聚丙烯酰胺为介质的区带电泳 ,常用于分离蛋白质 。它的优点是设备简单 、操作方便 、样品用量少 。等电聚焦是一种高分辨率的蛋白质分离技术 ,也可以用于蛋白质的等电点测定 。利用等电聚焦技术分离蛋白质混合物是在具有pH梯度的介质中进行的 。在外电场作用下各种蛋白质将移向并聚焦在等于其等电点的pH值梯度处形成一个窄条带 。孙臣忠等[18]研究了聚丙烯酰胺电泳 、等电聚焦电泳和等速提纯电泳在分离纯化蛋白质中的应用 。结果发现 ,聚丙烯酰胺电泳的条带分辨率低 ,加样量不高;等电聚焦电泳分辨率最高 ,可以分离同种蛋白的亚成分 ,加样量最小;等速提纯电泳区带分辨率较高 ,可将样品分成单一成分 ,加样量最大 。

离子交换层析(Ion exchange chromatography ,IEC)是以离子交换剂为固定相 ,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法 。离子交换层析中 ,基质由带有电荷的树脂或纤维素组成 。带有正电荷的为阴离子交换树脂;反之为阳离子交换树脂 。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化 。当蛋白质处于不同的pH值条件下 ,其带电状况也不同 。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质 ,被留在层析柱上 ,通过提高洗脱液中的盐浓度 ,将吸附在层析柱上的蛋白质洗脱下来 ,其中结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来 。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质 ,结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来 。李全宏等[19]将离子交换层析应用于浓缩苹果汁中蛋白质的提纯 。另外 ,离子交换层析还用于抗凝血蛋白的提取[7] 。

2.4 利用对配体的特异亲和力进行分离纯化

亲和层析是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力(即生物学亲和力)建立起来的一种有效的纯化方法 。它通常只需一步处理即可将目的蛋白质从复杂的混合物中分离出来 ,并且纯度相当高 。应用亲和层析须了解纯化物质的结构和生物学特性 ,以便设计出最好的分离条件 。近年来 ,亲和层析技术被广泛应用于靶标蛋白尤其是疫苗的分离纯化 ,特别是在融合蛋白的分离纯化上 ,亲和层析更是起到了举足轻重的作用 ,因为融合蛋白具有特异性结合能力[20] 。亲和层析在基因工程亚单位疫苗的分离纯化中应用也相当广泛[21] 。范继业等[22]利用壳聚糖亲和层析提取的抑肽酶比活达到71 428 BAEE·mg-1 ,纯化回收率达到62·5% 。该方法成本较低 ,吸附剂价格低廉 、机械强度高 、抗污染能力较强 、非特异性吸附较小 、可反复使用 、适用性广 ,产品质量稳定 。

3 展望

在实际工作中 ,很难用单一方法实现蛋白质的分离纯化 ,往往要综合几种方法才能提纯出一种蛋白质 。

理想的蛋白质分离提纯方法 ,要求产品纯度和总回收率越高越好 ,但实际上两者难以兼顾 ,因此 ,考虑分离

提纯的条件和方法时 ,不得不在两者之间作适当的选择;一般情况下 ,科研上更多地选择前者 ,工业生产上

更多地选择后者 。因此 ,每当需要提纯某种蛋白质时 ,首先要明确分离纯化的目的和蛋白质的性质 ,以便选择最佳的分离纯化方法 ,从而得到理想的效果 。今后 ,蛋白质提纯技术的发展将不断促进对蛋白质性质的研究 ,同时对蛋白质性质的研究也将反过来提高蛋白质分离纯化技术 ,两者的互相促进终将会对生命科学的进步作出重大贡献 。